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　　知識講解：細胞培養的步驟和注意事項

　　1:細胞復蘇

　　低溫保存的細胞從液氮中取出后，在37℃的水浴中不斷搖晃，以促進其融化。將解凍后的細胞移入離心管，加入37℃(胎牛血清約10%)預熱的DMEM培養基中，輕輕吹掃離心，500克離心2分鐘，丟棄上清液。

　　加入DMEM清洗，并丟棄上清液。加入DMEM全培養基，輕輕吹勻，制成細胞懸液，接種于皿/瓶中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。

　　2:細胞通道

　　當細胞密度達到80%～90%(早產不足，細胞條件不好，1:2～1:10或以上比例傳代，一般1:3～1:5細胞發生，即從細胞接種到分離再培養的一段時間內，非細胞有絲分裂的次數)，取出完整培養基，洗滌兩次1x PBS。

　　加入胰蛋白酶(注：消化液覆蓋細胞的最佳量，最佳消化溫度為37℃。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞。如果細胞質收縮，細胞不再連接成碎片，說明此時細胞的消化是合適的)，并將其放入細胞培養箱中約2-3分鐘。

　　加入適量DMEM全培養基停止胰蛋白酶消化，移入離心管離心2分鐘，棄去上清液，然后加入DMEM全培養基洗滌，棄去上清液。

　　加入DMEM全培養基，輕輕吹勻，取10μL計數，按要求的細胞體積在含5%CO2的細胞培養箱中繼續培養。

　　3:細胞冷凍保存

　　當細胞密度達到80%～90%時，去除全培養基，用1x PBS洗滌兩次。加入胰蛋白酶消化，放入細胞培養箱約2-3分鐘。加入DMEM全培養基停止胰蛋白酶消化，移入離心管，離心500g，離心2min，棄去上清液，然后加入DMEM全培養基洗滌，棄去上清液。加入LML凍存液(90%胎牛血清，10%二甲基亞砜)。一般來說，血清含量可以在10%到90%之間調節。一方面在凍存液中加入血清可以為細胞提供營養，另一方面可以提供蔗糖、白蛋白等不滲透的保護物質，在凍存過程中更好地保護細胞。放入低溫保存管(管內加入異丙醇，以保證降溫速度)，立即放入4℃冰箱內冷凍30分鐘，然后放入-20℃冰箱30分鐘，再放入-80℃冰箱過夜。

　　第二天放入液氮中，至少可以保存兩年。如果沒有，可以保存三個月。

　　細胞冷凍復蘇的原理是：緩慢冷凍和快速解凍，這樣更有利于保持細胞的活力。不加任何保護劑的細胞低溫保存會導致細胞內產生冰晶，引起細胞內的機械損傷、滲透壓、pH值和電解質的變化，進而導致細胞死亡。

　　4:注意事項

　　(1) 預熱培養液：將配制好的含培養液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴中預熱;

　　(2) 用75%酒精擦拭超凈工作臺和紫外線照射的手;

　　(3) 正確放置使用過的設備：保證足夠的操作空間，既方便操作又減少污染;

　　(4) 酒精燈：注意火焰不要太小;

　　(5) 嚴格無菌操作;

　　(6) 貼壁細胞的消化是中等的：消化時間受多種因素的影響，如消化液的種類、制備時間和加入培養瓶中的量。在消化過程中，應注意培養細胞形態的變化。一旦細胞質收縮，連接變松，或有碎片漂浮的跡象，消化應立即終止;

　　(7) 傳代細胞的所有操作應盡可能靠近酒精燈火焰。最好一次只操作一個電池，每個電池使用一套設備。避免交叉感染;

　　(8) 每次打開或關閉細胞瓶口時，都需要在酒精燈上消毒

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