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BUNSEN本生分享：PCR儀的原理、分類、常見問題
一、PCR的基本原理
聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction，PCR)PCR反應過程與細胞內的DNA復制相似，但PCR的反應體系要簡單的多，主要包括DNA靶序列、引物、4種單核苷酸dNTP、耐熱DNA聚合酶以及合適的緩沖液體系。
PCR反應過程有以下3個步驟：
1、變性
將反應體系混合物加熱到94℃，維持較短時間(大約15s-30s)，使目標DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA作為反應模板。
2、退火
將反應體系冷卻至特定的溫度(引物的TM值左右或以下)，引物與DNA模板的互補區結合，形成模板引物復合物。
3、延伸
將反應體系的溫度提高到72℃并維持一段時間，引物在耐熱聚合酶的作用下，以引物為固定起點，以4種單核苷酸(dNTP)作為底物合成新的DNA鏈。
以上三步作為一個循環重復的進行，每一循環的產物作為下一循環的模板。如此循環數十次，從而使目的基因得到指數級擴增，達到檢測或獲取基因的目的。
二、PCR儀的分類
根據DNA擴增的目的和檢測的標準可以將PCR儀分為：普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR，實時熒光定量PCR儀等幾類。
2.1普通PCR儀
一般把一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀。
如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運行。主要是用作簡單的，對目的基因退火溫度的擴增。
主要應用于科研、教學、臨床醫學、檢驗、檢疫等。
2.2梯度PCR儀
一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱之為梯度PCR儀。
因為被擴增的不同的DNA段其適合的退火溫度不同，通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的適合退火溫度進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣既節約時間，也節約經費。
在不設置梯度的情況下亦可當做普通的PCR用。真正的梯度，是每一排管都有準確的加熱控溫探頭。梯度PCR儀多應用于科研、教學機構。
2.3原位PCR儀
有些品牌的PCR儀具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通過替換模塊進行多用途開展實驗工作。是用于從細胞內靶DNA的定位分析的細胞內基因擴增儀。如病原基因在細胞的位置或目的基因在細胞內的作用位置等。可保持細胞或組織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置進行基因擴增。
不但可以檢測到靶DNA，還能標出靶序列在細胞內的位置。于分子和細胞水平上研究疾病的發病機理和臨床過程及病理的轉變有著重大的實用價值。
2.4實時熒光定量PCR儀(fluorescencerquantitivepolymerasechainreaction,FQPCR)
在普通PCR儀設計基礎上增加熒光信號激發和采集系統和計算機分析處理系統，形成了具有熒光定量PCR功能的儀器。
其PCR擴增原理和普通PCR擴增原理相同，在PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號采集系統實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統，得出量化的實時結果輸出。
熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道;有多種熒光標記的時候使用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記和目的基因表達產物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，實現一次檢測多種目的基因的功能。
實時熒光定量PCR儀主要應用于臨床醫學檢測、生物醫藥研發、食品行業、科研院校等。
實時熒光定量PCR儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。
實時熒光定量PCR的優勢：
熒光定量PCR儀比普通的PCR儀多了熒光信號采集系統和計算機分析處理系統，實時熒光定量PCR儀主要是用來定量分析和確定基因轉錄水平的，而普通的PCR儀是做定性分析和擴增基因片段，定量PCR儀可以做普通PCR儀的工作，但是成本太高。
樣品到達域值水平所經歷的循環數稱為Ct值(限制點的循環數)。域值應設定在使指數期的擴增效率為大，這樣可以獲得準確，可重復性的數據。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析將產生一條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。
熒光定量PCR儀特點：
1.特異性強：引物和探針的“雙保險"，避免檢測的假陽性。
2.靈敏度高：分析PCR產物的對數期，自動化儀器收集熒光信號，避免了許多人為因素干擾。
3.避免污染：全封閉反應，無須PCR后處理。
4.實現定量：運用標準品獲得標準曲線，結合Ct值進行準確定量。
5.高效低耗：可實現一管多檢。
6.操作簡便：在線式實時監測擴增結果，不必接觸有害物質。
7.快速：反應時間<1.5小時。
三、PCR常見問題匯總
1.無擴增條帶
(1)酶失活或在反應體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或運輸不
當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。
(2)模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。
(3)變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活;過低則模板變性不*。
(4)反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應
體系95℃加熱5-10分鐘。
(5)引物變質失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。
(6)引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。
(7)DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。
2.PCR產物量過少
(1)退火溫度不合適。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。
(2)DNA模板量太少。增加DNA模板量。
(3)PCR循環數不足。增加反應循環數。
(4)引物量不足。增加體系中引物含量。
(5)延伸時間太短。以1kb/分鐘的原則設置延伸時間。
(6)變性時間過長。變性時間過長會導致DNA聚合酶失活。
(7)DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈
3.擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
(1)酶量過高。減少酶量;酶的質量差，調換另一來源的酶。
(2)dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
(3)MgCl2濃度過高。可適當降低其用量。
(4)模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。
(5)引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。
(6)循環次數過多;增加模板量減少循環次數至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環。
(7)退火溫度過低。
(8)電泳體系有問題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大;
②凝膠沒有凝固好;
③瓊脂糖質量差。
(9)若為PCR試劑盒則可能：
①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效;
②試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。
(10)降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。
4.擴增產物出現多條帶(雜帶)
(1)引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。
(2)循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。
(3)酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。
(4)退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。
(5)樣品處理不當。
(6)Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。
(7)若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。
(8)復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備
反應體系或采用熱啟動聚合酶。
(9)反應緩沖液未*融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完quan并*混勻。
(10)引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。
(11)引物量過多。減少反應體系中引物的用量。
(12)模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應
<200ng。
(13)外源DNA污染。確保操作的潔凈。
5.陰性對照出現條帶
試劑，槍頭，工作臺污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清
潔。
6.條帶大小與理論不符
1)污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。
2)模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。
3)基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。
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