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熒光定量PCR試劑盒在實驗關鍵步驟及注意事項
以下是熒光定量PCR(qPCR)試劑盒實驗的關鍵步驟及注意事項，天津本生結合操作規范與常見問題解決方案：
一、實驗前準備?
試劑與耗材?
使用無RNase/DNase的槍頭、EP管，避免RNA降解?。
試劑盒組分需提前平衡至室溫(20-25℃)，避免溫度波動影響反應效率?。
樣本處理?
RNA提取后需檢測濃度(A260/A280=1.8-2.0)及完整性(RIN≥7)?。
反轉錄cDNA時需設置無模板對照(NTC)和基因組DNA去除步驟?。
二、反應體系配置?
加樣順序?
推薦先配制主反應混合液(含酶、dNTPs、緩沖液等)，再分裝至各孔，最后加入模板?。
加樣誤差需<5%，避免交叉污染(如使用排槍或自動化工作站)?。
關鍵參數?
引物終濃度通常為0.1-1μM，需通過梯度實驗優化?。
SYBR Green法需設置熔解曲線分析引物二聚體?。
三、儀器操作?
程序設置?
三步法程序：95℃預變性10分鐘→(95℃ 15秒→60℃ 30秒→72℃ 30秒)×40循環?。
熒光信號采集需設置在退火/延伸階段(SYBR Green法)或探針結合階段(TaqMan法)?。
數據采集?
基線范圍設為3-15循環，閾值設為指數期熒光信號10倍標準差?。
四、常見問題與解決?
問題? ?可能原因? ?解決方案?
擴增曲線斷裂 氣泡干擾或模板濃度過高 瞬離去除氣泡，稀釋模板?
無擴增信號 引物降解或反應條件不匹配 重新設計引物，優化退火溫度?
熔解曲線多峰 引物二聚體或非特異擴增 重新設計引物或提高退火溫度?
注：不同品牌試劑盒參數可能差異較大，建議以實際說明書為準?。
注：僅供科研使用，以上資料供參考，如需具體產品說明請咨詢技術老師或品牌供應商。
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